共焦点显微镜脊髓的免疫荧光protocol组化流程

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1.动物麻醉后经心脏插管至主动脉,灌注生理盐水约300-400ml后,再灌入4%多聚甲醛(含1.5%苦味酸，0.01mol/L PBS)约300ml.取腰部脊髓放入上述溶液里后固定3h。
2.将脊髓组织移入15%蔗糖（0.01mol/L PBS)固定4度过夜沉底.取出组织滤干pbs，放入盛有液氮的小盒冷却直至oct变白固定。
3.冷冻切片20um（文献是30um）。放在载玻片上。
4.PBS振洗，5min，3次。
5.吸去多余的pbs，用DAKO pen在组织周围画圈，加入2%正常山羊血清含0.3％Triton x-100的0.01M PBS。封闭30分钟。
6.滴加一抗（gfap,mouse IgG1），于湿润箱内4度过夜。
7.PBS振洗，5min，4次。
8.此处开始遮光，分别滴加二抗(gfap, goat anti-mouse IgG1 FITC)，放入荧光用湿润箱里，4度过夜。
9.PBS振洗5min，4次。
10.封片剂封片，nail oil裱片。
11.暗室操作共焦点显微镜观察。 

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